FightAIDS@Home Project Update - Volume 11
Feb. 12th, 2013 04:40 am![[personal profile]](https://www.dreamwidth.org/img/silk/identity/user.png){kind=small}
parohhttp://fightaidsathome.scripps.edu/images/FAAHvol11.pdf
ВИЧ, вирус, который вызывает СПИД, поражает более 34 миллионов человек, а примерно 2,3 до 2,8 млн новых людей заражаются каждый год. ВИЧ убивает больше людей, чем любой другой вирус на Земле. Даже если/когда мы сможем в конечном итоге предотвратить новые случаи инфицирования ВИЧ с вакцинами или анти-вирусными микробицидами, мы все еще должны открыть новые препараты, которые могут помочь в лечении миллионов людей, которые в настоящее время живут с ВИЧ инфекцией. Необходимость открыть новые типы препаратов против ВИЧ особенно актуально, поскольку новые мульти-лекарственно-устойчивые мутанты "супербактерии" ВИЧ постоянно развиваются и распространяются по всему человечеству. Кроме того, другие ученые показали, что лечение ВИЧ инфекции эффективными препаратами также помогает снизить вероятность распространения инфекции с новыми людьми. Когда эффективные препараты даются конкретному пациенту, число инфекционных вирусных частиц в этом пациенте (или «вирусная нагрузка») уменьшается, что снижает для них вероятность заражения других людей. Это не исключает возможности распространения инфекции, но это действительно уменьшает вероятность. Поэтому, помогая нам продвигать открытия новых анти-ВИЧ лекарств, у нас есть потенциал, чтобы помочь в лечении как настоящих ВИЧ-инфицированных пациентов, так и предотвратить распространение этого смертельного вируса.
Почему мы выполняем эти расчеты? Проект FightAIDS@Home использует добровольные компьютерные мощности АйБиЭмовского Мирового Сетевого Сообщества чтобы протестировать соединения-кандидаты против вариаций (или «мутантов») ВИЧ, которые могут возникнуть и вызвать устойчивость к лекарственному средству. Мы проверяем эти кандидаты на "стыковку" их гибких моделей с 3-мерными атомно-масштабированными моделями различных лекарственных препаратов от ВИЧ-инфекции, чтобы предсказать (а) насколько сильно эти соединения могли бы связываться, (б), где эти соединения, вероятно, предпочитают связываться с белком-целью, и (в) какие конкретно взаимодействия, по-видимому, сформируются между кандидатом и целью. Соединения, которые могут связываться плотно с правыми регионами отдельных белков из ВИЧ имеют потенциал "прилепиться как жвачка" и прекратить вирусный механизм и, таким образом, способствовать продвижению открытия новых типов препаратов для лечения ВИЧ-инфекции.
Основная информация о последних достижениях: расчеты FightAIDS@Home привели к открытию 10 новых фрагментов, которые связывают ВИЧ-протеазу, изменяют ее стабильность и/или влияют на ее конформационные предпочтения. Эти 10 фрагментов из эксперимента 30 по прогнозам связываются либо “4D9 экзо участка” на стороне ВИЧ-протеазы или с потенциальным аллостерическим участком на вершине клапанов протеазы ( "1F1" участка"). Смотрите изображения на странице 2, для обнаружения этих местоположений. Соединения, которые можно привязать к любому из этих местоположений с высоким аффинитетом ( высокой эффективностью ) в конечном итоге могут привести к развитию совершенно нового типа антиВИЧ препаратов, могущих остановить деятельность активных участков (полый тоннель в центре). Мы еще не имеем никаких доказательств о том, где на самом деле эти соединения привязываются к протеазе, но наши сотрудники в Stout лаборатории в настоящее время пытаются создать доказательства. Эти 10 новых успешных фрагментов прогнозированно свяжутся с двумя потенциальными аллостерическими участками, и у нас есть доказательства того, что эти соединения завязываются где-то на ВИЧ-протеазе и влияют на ее стабильность и конформационную
предпочтительность. Наши сотрудники д-р Макс Чанг, в лаборатории Брюса Торбетта и д-р Майкл Бакш в лаборатории М.Г. Финна показали, что что эти соединения способны связываться с ВИЧ-протеазой в растворе ( протеаза ВИЧ, растворенная в воде ) и они вызывают дозозависимое влияние на ее термостабильность ( ее температуру плавления, температура при которой вирусный фермент разворачивается), и/или ее конформационную предпочтительность. Важно отметить, что 4 новые удачи предсказаноо свяжутся с 4D9 экзо участком (голубые сферы на изображения A и B слева) способны затормозить в бипротеазу ВИЧ в биологиеских анализах, выполненными д-ром Инг-Чуань-Линем в лаборатории Джона Элдера. Хотя эти четыре фрагмента очень маленькие, слабые ингибиторы протеазы ВИЧ, они представляют первые соединения, которые мы когда-либо выявили на виртуальных экранах, против этих двух участков, которые были способны затормозить деятельность ВИЧ-протеазы в лаборатории. Как только наши сотрудники показали, что эти фрагменты показывают активность в в отношении ВИЧ-протеазы, эти четыре новые хита были прозваны от "APex41" до "APex44" (для Alex Perryman в экзо сайте 4D9 соединения 1-4).
Открытие этих двух потенциальных аллостерических участков ( на которые мы нацелены в настоящее время ) была представлена в манускрипте “Fragment-Based Screen against HIV protease,” by Alexander L. Perryman, Qing Zhang, Holly H. Soutter, Robin Rosenfeld, Duncan E. McRee, Arthur J. Olson, John E. Elder, and C. David Stout, in the journal Chemical Biology & Drug Design, 75(3), pages 257-268 (2010).
Прочитайте остальную часть этого бюллетеня, чтобы узнать о подробностях этого эксперимента, и как мы идем на это. Для общего резюме проекта FightAIDS @ Home, посмотрите клип YouTube д-ра Алекса Перримана интервьюированного Аароном Роу, журналистом из Chemical & Engineering News (“C&E News”) по адресу: http://youtu.be/V6gzc8uUGJw . Для просмотра вебинара, который обсуждает FightAIDS @ Home и того прогресса, которого мы добились в прошлом году (с последующими 15 минутами вопросов и ответов для публики), смотрите http://www.youtube.com/watch?v=khFbQTcoqyI.
Что такое "расчеты стыковок" (“docking calculations”), виртуальные экраны (“virtual screens") и "лекарственно-устойчивые мутанты" ("drug-resistant mutants”?).
Расчеты стыковок - это способ предсказать насколько хорошо небольшое химическое соединение может связать и заблокировать активность исследуемого белка. Мы используем эти вычисления, чтобы предсказать родовое сходство и результативность соединения, место, где оно соединяется с молекулярной целью и режим, который оно использует, чтобы потенциально заблокировать цель. Эти прогнозы помогают нам направлять и объяснить пробирочные эксперементы ( т.е., мокрые эксперименты в пробирках, чашках Петри, и т.д.) которые выполняют наши сотрудники. Виртуальными экранами являются большие вычислительные эксперименты, которые включают стыковочную коллекцию от сотен и тысяч до миллионов соединений против отдельных регионов критических белковых целей по одному. Эти виртуальные экраны, что мы выполняем на FightAIDS@Home похожи на попытку найти правильный ключ, чтобы открыть конкретный замок на контрольных панелях, которые регулируют вирусный механизм. Однако, и замок и ключи гибкие - они могут менять форму ( преобразовывать их конформации ) так как они покачиваются, трясутся, танцуют, растягиваются и сжимаются в теплой водянистой среде, в которой они проживают. Если, случайно, внутренняя структура замка меняется немного, так как вирус размножается, происходит потенциал для эволюционного совершенствования. Если это изменение в ценной части замка происходит, чтобы помочь вирусу избежать последствий ключа/лекарства (в то же время позволяя ему выполнять свои нормальные биологические функции), то новый замок становится "лекарственно-устойчивым мутантом". Поскольку ВИЧ копирует себя в очень неаккуратной манере, эти случайные изменения происходят очень часто, что дает ВИЧ возможность быстро развивать сопротивляемость различным препаратам, которые используются для борьбы с ним.
Мы ищем новых тормозящих агентов ("inhibitors") (новые ключи), которые не только могут отключить мутантов супер-бактерий ВИЧ, которые уже существуют, но также затрудняют эволюцию вируса в новые устойчивые к лекарствам мутированные формы. Охота за новыми ключами/лекарствами очень запутанный и сложный процесс, по причинам, обсуждавшимся ранее и тому факту, что эти вычислительные прогнозы не являются абсолютно точными. Вдобавок, общее число потенциальных «ключей» (небольшие органические соединения), которые, вероятно, существуют во Вселенной (т.е. размер "химического пространства" ("chemical space") оцениваются как 10 в 60-й степени (т.е. 1 с 60-ю нулями). Мы, очевидно, не можем вычислительно оценить гибкие модели такого большого количества ключей, так что нам приходится сосредоточить те эксперименты на типах ключей, которые которые несколько похожи на типы молекул, которые уже стали утвержденными препаратами ( или маленькие, представительные кусочки этих молекул, называемые "фрагменты" ). Вместо того чтобы искать иголку в стоге сена, мы ищем иголку в многих полях, полных стогов и мы можем только обыскать небольшой процент из них. Чтобы узнать более подробную информацию об этих расчетах стыковок смотрите http://fightaidsathome.scripps.edu/discovery.html или http://gofightagainstmalaria.scripps.edu/index.php/project-details. До сих пор мы получили более 168 тысяч лет бесплатных процессорных расчетов на World Community Grid для продвижения проекта FightAIDS@Home.
Что такое белки, что делает ВИЧ-протеаза и почему мы хотим заблокировать ее деятельность? Белки являются полимерами, которые создаются путем ковалентного присоединения ( постоянные химические крепления ) различных единиц пептидов вместе. Пептиды также называют "аминокислоты" и есть более 20 различных вкусов пептидов, которые делятся на 3 основные категории: заряженные, полярные и гидрофобные. Поскольку белком является полимер, сделанный из пептидов, он также называется "полипетидом". Каждый вид белка состоит из определенной последовательности различных единиц пептидов объединенных в конкретном порядке, чтобы составить линейную цепочку (в чем-то похоже на жемчужное ожерелье, если бы у жемчужин были разные размеры и химические свойства). После того как полипептидная цепь создается, количество и порядок следования различных аминокислот в ней заставляет ее сложиться в определенную коллекцию, или ансамбль, компактных 3-д формы (конформаций). Большинство человеческих белков выполнены в виде индивидуальных, раздельных полипептидных цепей: одна полипептидная цепь производит один белок. Но компоненты ВИЧ, сделаны в совершенно иной манере: когда генетический материал вируса направляет инфицированные клетки для создания белков ВИЧ, производятся длинные, многобелковые полипептидные цепи.
ВИЧ-протеаза это "фермент" ("enzyme"). Ферменты (которые, как правило, имеют имена, заканчивающиеся на "аз") являются белками, выполняющими химическую работу (такую как присоединение вещей друг к другу, разъединене вещей друг от друга или изменение конкретных небольших органических веществ или больших биологических макромолекул). В ВИЧ-протеазу входит длинная, вирусная, многобелковая полипептидная цепь в нескольких различных конкретных местах. Резка этой мультибелковой цепи на различные части, позволит потом этим различным частям свернуться к их нормальным, зрелым конфирмациям. Те, сложенные вирусные белки затем работают вместе, чтобы создать новые частицы ВИЧ, сбежавшие из зараженной клетки ( или "почки" ), взрослеют, а потом заражают новые клетки, которые распространяют инфекцию внутри пациента и позволяют инфекции распространяться на новых людей. Когда активность ВИЧ-протеазы существенно нарушается, то те несколько мультибелковых вирусных полипептидных цепей больше не отделены в эффективной, хорошо упорядоченной манере. Это заставляет зараженную клетку производить незрелые вирусные частицы, которые не способны инфицировать другие клетки. Наибольшее значение играет то, что когда препараты ВИЧ-протеазы сочетали с препаратами обратной транскриптазы ВИЧ, частота смерти, ассоциированной с ВИЧ-инфекциями резко сокращалось. До существования лекарств ВИЧ-протеазы получение ВИЧ было в основном быстрым и ужасным смертным приговором. Когда лекарства ВИЧ-протеазы были соединены с другими классами противоВИЧ лекарствами, чтобы сделать ВААРТ (HAART) коктейли (высокоактивной антиретровирусной терапии), то многие ВИЧ-инфицированные пациенты смогли прожить долгую и продуктивную жизнь с разумным качеством жизни. Однако, поскольку ВИЧ продолжает развиваться в несколько иных формах, которые способны сопротивляться воздействию этих препаратов (то есть, новые лекарственно-устойчивые мутанты супербактерии продолжают появляться и распространяться), мы должны открыть новые виды лекарств, которые смогут отключить этих мутантов.
Что такое аллостерические замедлители реакции (allosteric inhibitors)? Большинство ингибиторов отключает функцию фермента, связываясь непосредственно с "активным участком" ("active site") ( конкретным регионом фермента, где происходит химическая работа) и блокирует его возможность функионировать. 9 утвержденных FDA препаратов являются примером этих традиционных типов ингибиторов: они связывают и блокируют активный центр в полости туннеля в центре протеазы, что предотвращает вирусный мультипротеиновый полипептид от возможности связаться внутри этого туннеля и раздвоиться. Аллостерические торможения похожи на то, как положить защелки на ручки ножниц, чтобы предотвратить лезвия от открывания и закрывания и резать вещи. Большинство мутаций в ВИЧ-протеазе, вызывающие устойчивость обычно происходит внутри этого активного участка туннеля; они предохраняют лекарства от возможности тесно переплестись, но они все же позволяют вирусному мультипротеиновому полипептиду переплетаться и раздваиваться на разные куски. Активный центр протеазы ВИЧ охраняют два высококвалифицированных мобильных клапана, которые образуют крышу туннеля активного сайта. Эти клапаны должны быть в состоянии открыться, чтобы разрешить вирусному мультипротеиновому полипептиду войти в активный участок и они должны быть в состоянии закрыться, для того, чтобы позиционировать правильную область этого полипептида внутри активного участка, так что он плотно связывается и создает надлежащую химическую окружающую среду, которая позволяет измельчениям происходить. Эти клапаны должны потом снова открыться, чтобы заставить размножившиеся продукты сбежать (а затем свернуться) и чтобы разрешить новому мультипротеиновому полипептиду ( или новой области свежеразмножившихся мультипротеиновых полипептидов) переплестись. Мы ищем аллостерические ингибиторы, потому что мы хотим найти способ регулировать поведение открытия и закрытия клапана. Если клапаны не смогут открываться и закрываться, то ВИЧ-протеаза не сможет функционировать.
Некоторые лекарственно-устойчивые мутации ВИЧ-протеазы, похоже, предпочитают выборки конформации, которые открывают клапаны чаще чем обычно, "дикого типа" версия предпочитает их. Это делает более трудным для препаратов плотно сплестись с активным участком и закрыть эти клапаны в закрытую конформацию. Если мы сможем обнаружить аллостерические ингибиторов протеазы, которые помогают закрыть заслонки и/или помогают держать клапаны закрытыми, тогда эти соединения должны помочь восстановлению потенциала теперешних препаратов протеазы против этих мутантов супербактерий.
Поскольку мутации случайным образом возникают, когда вирус воспроизводит себя, это гораздо сложнее и занимает больше времени для вируса накапливать мутации в обоих аллостерическом участке и в активном участке вирусной молекулы ( таким образом, что предотвращает оба типа препаратов от возможности связаться, хотя все еще разрешая энзиму эффективно функционировать ). Следовательно, разработка новых комбинаций, которые включают ингибиторы активных участков ВИЧ-протеазы и аллостерические ингибиторы протеазы должны не только отключить мутантов супербактерий протеаз, что существуют в настоящее время, она должна также препятствовать появлению новых типов супербактерий в будущем. Существует ряд доказательств в поддержку этой амбициозной долгосрочной цели: в других системах, таких как Bcr-Abl ( задание для раковой химиотерапии ) и обратной транскриптазы ВИЧ, было показано, что комбинации ингибиторов активного участка и аллостерических ингибиторов замедлит развитие мутаций, усточивых к препаратам.
Как мы обнаружили эти новые фрагменты, которые связываются с ВИЧ-протеазой? 30-й эксперимент FightAIDS@Home задействовал стыковку ~360000 различных соединений из библиотеки "Asinex" с двумя потенциальными аллостерическими участками, которые мы помогли оьнаружить ранне. См. статью от 2010 года, ссылка на которую была приведена внизу страницы 2. По сути, эксперимент 30 состоит из двух различных половин - первая половина включает в себя "скрининг" этих 360000 соединений против потенциальных аллостерических участков на верху клапанов, используя 1F1-связанную кристаллическую структуру протеазы ВИЧ как цель. Вторая половина задействует стыковку этих 360000 соединений против потенциальных аллостерических участков на сторонах протеазы ВИЧ, используя 4D9-связанную кристаллическую структуру протеазы ВИЧ как цель. Каждая половина эксперимента была проанализирована независимо друг от друга. Вычислительные средства, разработанные в доме доктора Стефано Форли (с некоторой помощью д-ра Ruth Huey и адъюнкт-профессора Мишель Саннер) были использованы для обработки, а затем измерения взаимодействия отображений во всех этих результатах стыковки. Эти инструменты были затем использованы для "фильтрования" результатов, для того, чтобы собрать небольшое число топ-рейтинг соединений. Доктор Алекс Перриман создал определенный набор активных и интерактивно основанных фильтров для каждого из двух участков и он обычно визуально осматривает и переоценивает топ соединений, которые прошли через каждый набор фильтров для определения небольшого набора перспективных соединений кандидата.
Для 360000 соединений пристыкованных к участку 1F1 в верхней части клапанов, 33 соединения прошли через первый набор фильтров и были визуально наблюдаемы ( с использованием PMV, Python Molecular Viewer, програму из лаборатории адъюнкт-профессора Мишель Саннер и лаборатории профессора Арта Олсона. Из этих 33 топ-реййтинговых соединений мы решили заказать 10 соединений, чтобы наши сотрудники могли изучить их во влажных экспериментах лаборатории. Эти 10 соединений и соединения обсуждаемые на страницах 7-8 были приобретены с помощью некоторых средств, которые были переданы в дар FightAIDS@Home от IBM International Foundation (т.е., частью призовых денег, которые выиграл компьтер IBM "Ватсон" на Jeopardy, см:
http://www-03.ibm.com/press/us/en/pressrelease/33752.wss или
http://www.scripps.edu/newsandviews/e_20110228/etc.html). Из этих 10 перспективных соединений, 6 фрагментов были классифицированы как «хиты» по результатам, по крайней мере, одного типа экспериментального анализа. Наши сотрудники в лаборатории Стаут в настоящее время пытаются кристаллизовать эти хиты с ВИЧ-протеазой, для получения доказательств о том, где на самом деле эти соединения связываются и подробный режим привязки, который они показывают в этом месте. Эти 6 хитов, изображены на рисунках E-K на стр. 5, еще не отображаются любое замедление активности протеазы ВИЧ. Они очень мелкие фрагменты, в конце концов. о 5 из этих 6 фрагментов (A3, A5, A6, A7, и A8) вызвали значительный сдвиг в тепловой стабильности протеазы ВИЧ в анализах DSF (differential scanning fluorimetry) (дифференциальной сканирующей флуориметрии) в лаборатории Торбетта, где доказали, что они способны связываться где-то на ВИЧ-протеазе (в растворе) и влиять на ее общую стабильность, в зависимости от дозы (то есть, большое количество соединения вызывает большие изменения в термической стабильности протеазы, что показывает, что соединения связываются определенным образом). Фрагмент A4 не вызывает значительных тепловых изменений, но он был классифицирован как хит, в соответствии с SPR (поверхностный плазменный резонанс, который включает в себя анализ изменения угла отражения лазера, возникающего когда соединение связывается с белком-целью, который был присоединен к поверхности золота или серебра, см. http://en.wikipedia.org/wiki/Surface_plasmon_resonance) экспериментами, проводимыми лабораториями Торбетта и Финна. Фрагмент A4 также отображает 53 мкм близость в BSI экспериментах, выполненными лабораторией Финн (обратное рассеяние интерферометрии, новая техника, которая определяет максимальное изменение показателя преломления, что происходит, когда растворенное вещество связывает с разбавленный раствор белка; когда соединение меняет общей конформационные предпочтения протеазы, это приводит к изменению показателя преломления раствора). BSI данные также зависят от дозы. Фрагменты A5 и A8 также отображаются низкой близостью мкм в BSI, в то время как фрагмент A7 отображается > 1 мм близости в BSI (то есть, A7 связывает в 1000 раз менее плотно). Другие фрагменты не показалии хорошо интерпретируемых сигналов в BSI. Различные типы соединений работают лучше или хуже в различных типах экспериментальных анализов, поэтому наши сотрудники должны выполнять много различных типов экспериментов, чтобы понять, насколько хорошо эти соединения фактически действуют. Мы используем данные по этим 6 хитовым фрагментам, чтобы руководить открытием и развитием более крупных и мощных соединений, которые, надеемся, смогут связываться с участком 1F1 и показывать торможение активности протеазы ВИЧ. Но по-прежнему еще предстоит выяснить способна ли связывание на участке 1F1 действительно отключить функцию активного участка.
Из 360000 соединений состыкованных с участком 4d9 по бокам протеазы, 160 соединений пропускают через другой набор активных и интерактивно основанных фильтров и были визуально осмотрены доктором Алексом Перриманом. Мы решили заказать 34 из этих соединений, из которых 4 были классифицированы как хиты. Все 4 из этих хитов (APex41 до APex44, смотрите рисунки L-O на этой странице) вызывают значительный сдвиг в термической стабильности протеазы ВИЧ в анализах DSF выполненных в лаборатории Торбетта. APex41 и APex42 показывают 4.3 и 2.7 мкм близость, в экспериментах BSI выполненных в лаборатории Финна, в то время как у APex43 и APex44 не было обнаруженных сигналов в BSI. Важно отметить, что все 4 из этих хитов показывают некоторое замедление активности протеазе ВИЧ в биологических анализаз, выполненных в лаборатории Элдера. При концентрации 100мкм APex41 сдерживает активность протеазы на 9%, в то время как APex42 до 44 сдерживает активность протеазы на 6%, 2% и 3%, соответственно. Хотя это очень слабые ингибиторы активности протеазы ВИЧ, они небольшие фрагменты, и они первый набор соединений, обнаруженных в виртуальных экранах против этих потенциальных аллостерических участков, что на самом деле ингибирует протеазы ВИЧ активности в биологических анализах. Но, как и с другим набором хитов, мы до сих пор еще не имеем никаких доказательств о том, где на самом деле эти соединения связываются с ВИЧ-протеазой. Наши сотрудники в лаборатории Стаут в настоящее время пытаются кристаллизовать эти хиты с протеазы, для создания доказательства того, где эти соединения связываются и какие взаимодействия они образуют. Мы также собираемся начать новый тип сотрудничества с лабораторией Kojetín на TSRI-Флорида, которые будут связаны с использованием спектроскопии ЯМР чтобы предоставить дополнительные данные о том, где эти хиты на самом деле связываются. Мы используем данные по этим 4 хитам, штриховки "автолиганд", медицинское понимание химии, предоставленное лабораторией Фокина и лабораторией Финна, чтобы направлять дизайн и разработку бОльших которые, мы надеемся, свяжутся с участком 4d9 с более высоким сродством и про демонстрируют более значительное ингибирование активности протеазы ВИЧ.
Как мы расширили эксперимент 30, чтобы найти более крупные и мощные ингибиторы? Поскольку четыре хита, APex41 - APex44, показывают замедление активности протеазы ВИЧ, и были структурно похожи друг на друга, их структурные детали были использованы для руководства строительством "целенаправленной библиотеки" примерно 2600-ти новых соединений. Доктор Перриман искал и визуально исследовал сервер ZINC (http://zinc.docking.org) чтобы вручную подобрать эти 2600 соединений. Большинство из этих соединений гораздо больше и сложнее, чем оригинальный APex4, однако, некоторые из них имеют такой же размер, но они позволят нам изучить различные Структурно-Активные Отношения, для того, чтобы определить, какие типы структурных особенностей увеличивают или уменьшают активность этих соединений. Эта целенаправленная библиотека 2600-ти соединений была затем простыкована с той же 4D9-граничной кристаллической структурой ВИЧ-протеазы, но на этот раз мы использовали наши местные Linux кластера на TSRI. После применения аналогичных наборов энергетических и интерактивно-основанных фильтров, 213 соединений были пожаты и их связанные режимы были визуально освидетельствованы д-ром Перриманом. Во время этого процесса визуального осмотра, результаты вычислений "автолиганда" были использованы как руководство. Автолиганд это программа из лаборатории Олсон, которая обнаруживает лиганды связанных участков и описывает в общих чертах химические соединения, которые должны иметь максимальное сродство данного объема. Смотрите рисунки P и Q и... (пропущена строчка) Harris, R., Olson, A.J., and Goodsell, D.S. Автоматизированнре прогнозирование лигандов связывающих участки в белках. Белки, 70 (4): 1506-1517 (2008). Мы определили и заказали 43 новых соединений-кандидатов. Эти 43 кандидата в настоящее время изучаются в биологических анализах, выполняющихся в лаборатории Элдера. Анализы начались недавно и все еще продолжаются, но по крайней мере 2 из этих 43 кандидатов, уже показывают некоторое замедление активности протеазы ВИЧ. Исходя из слабо связывающих фрагментов и расширения их, чтобы найти гораздо больше, гораздо более мощные лекарственно-подобные молекулы, вероятно, потребуется много различных шагов и несколько лет. Но наше путешествие на этом захватывающем пути открытий уже начало приносить свои плоды.
Хотя эти направления исследуются, мы в настоящее время скриним миллионы других соединений против этих потенциальных аллостерических участков на FightAIDS@Home. Пожалуйста, помогите нам найти аллостерические ингибиторы целей препаратов от ВИЧ жертвуя неиспользуемые компьютерные циклы в World Community Grid.
Рис. на стр.2:
Эти изображения показывают местоположение двух потенциальных аллостерических участков связывания, что были направлены в FightAIDS@Home эксперимент 30. Рисунки A и B показывают местонахождение "участка 4D9" по ВИЧ-протеазы, в то время как C и D показывают расположение "участка 1F1" в верхней части клапанов. Голубые сферы представляют собой наложение 4 новых хитов фрагментов, выявленных в виртуальных экранах против участка 4D9, в то время как желтые сферы являются наложением новых 6-ти фрагментов хитов, обнаруженных в виртуальных экранах против участка 1F1. A и D изображают ленточную/мультяшную модель позвоночника протеазы, в то время как B и C показывают поверхность протеазы. Активный участок, ( где связываются 9 утвержденных FDA препаратов ВИЧ-протеазы) это полый туннель в центре каждого изображения.
Рис. на стр.5:
Эти изображения показывают 6 новых фрагментов хитов, выявленных в виртуальных экранах против участка 1F1 в верхней части клапанов. Рисунки от E до J показывают предсказанные режимы связывания соединений A3, A4, A5, A6, A7 и A8 как желтые сферы на фиолетовой поверхности представления протеазы, в то время как K изображает наложения этих 6 хитов на ленточную/мультяшную модель основы ВИЧ-протеазы.
Рис. на стр.7:
Эти изображения показывают предсказанный режим связывания 4-х новых хитов, открытых против экзо участка 4D9 как голубые сферы на пурпурной поверхности ВИЧ-протеазы. Изображение L изображает APex41, M отображает APex42, N показывает APex43, и O представляет APex44. APex41 также показан как желтые сферы на верху страницы 1, наряду с заполнением Автолиганд.
Рис. на стр.8:
Изображения P и Q показывают результаты расчетов АвтоЛиганда на границе участка 4D9 кристаллической структуры протеазы. Ленточно/мультяшный режим основы протеазы показан на Q и R, поверхность протеазы отображается в P, в то время как заполняющие пространство "CPK" представление используется в S. 43 новых кандидатов показаны как голубые палки в R и S.
ВИЧ, вирус, который вызывает СПИД, поражает более 34 миллионов человек, а примерно 2,3 до 2,8 млн новых людей заражаются каждый год. ВИЧ убивает больше людей, чем любой другой вирус на Земле. Даже если/когда мы сможем в конечном итоге предотвратить новые случаи инфицирования ВИЧ с вакцинами или анти-вирусными микробицидами, мы все еще должны открыть новые препараты, которые могут помочь в лечении миллионов людей, которые в настоящее время живут с ВИЧ инфекцией. Необходимость открыть новые типы препаратов против ВИЧ особенно актуально, поскольку новые мульти-лекарственно-устойчивые мутанты "супербактерии" ВИЧ постоянно развиваются и распространяются по всему человечеству. Кроме того, другие ученые показали, что лечение ВИЧ инфекции эффективными препаратами также помогает снизить вероятность распространения инфекции с новыми людьми. Когда эффективные препараты даются конкретному пациенту, число инфекционных вирусных частиц в этом пациенте (или «вирусная нагрузка») уменьшается, что снижает для них вероятность заражения других людей. Это не исключает возможности распространения инфекции, но это действительно уменьшает вероятность. Поэтому, помогая нам продвигать открытия новых анти-ВИЧ лекарств, у нас есть потенциал, чтобы помочь в лечении как настоящих ВИЧ-инфицированных пациентов, так и предотвратить распространение этого смертельного вируса.
Почему мы выполняем эти расчеты? Проект FightAIDS@Home использует добровольные компьютерные мощности АйБиЭмовского Мирового Сетевого Сообщества чтобы протестировать соединения-кандидаты против вариаций (или «мутантов») ВИЧ, которые могут возникнуть и вызвать устойчивость к лекарственному средству. Мы проверяем эти кандидаты на "стыковку" их гибких моделей с 3-мерными атомно-масштабированными моделями различных лекарственных препаратов от ВИЧ-инфекции, чтобы предсказать (а) насколько сильно эти соединения могли бы связываться, (б), где эти соединения, вероятно, предпочитают связываться с белком-целью, и (в) какие конкретно взаимодействия, по-видимому, сформируются между кандидатом и целью. Соединения, которые могут связываться плотно с правыми регионами отдельных белков из ВИЧ имеют потенциал "прилепиться как жвачка" и прекратить вирусный механизм и, таким образом, способствовать продвижению открытия новых типов препаратов для лечения ВИЧ-инфекции.
Основная информация о последних достижениях: расчеты FightAIDS@Home привели к открытию 10 новых фрагментов, которые связывают ВИЧ-протеазу, изменяют ее стабильность и/или влияют на ее конформационные предпочтения. Эти 10 фрагментов из эксперимента 30 по прогнозам связываются либо “4D9 экзо участка” на стороне ВИЧ-протеазы или с потенциальным аллостерическим участком на вершине клапанов протеазы ( "1F1" участка"). Смотрите изображения на странице 2, для обнаружения этих местоположений. Соединения, которые можно привязать к любому из этих местоположений с высоким аффинитетом ( высокой эффективностью ) в конечном итоге могут привести к развитию совершенно нового типа антиВИЧ препаратов, могущих остановить деятельность активных участков (полый тоннель в центре). Мы еще не имеем никаких доказательств о том, где на самом деле эти соединения привязываются к протеазе, но наши сотрудники в Stout лаборатории в настоящее время пытаются создать доказательства. Эти 10 новых успешных фрагментов прогнозированно свяжутся с двумя потенциальными аллостерическими участками, и у нас есть доказательства того, что эти соединения завязываются где-то на ВИЧ-протеазе и влияют на ее стабильность и конформационную
предпочтительность. Наши сотрудники д-р Макс Чанг, в лаборатории Брюса Торбетта и д-р Майкл Бакш в лаборатории М.Г. Финна показали, что что эти соединения способны связываться с ВИЧ-протеазой в растворе ( протеаза ВИЧ, растворенная в воде ) и они вызывают дозозависимое влияние на ее термостабильность ( ее температуру плавления, температура при которой вирусный фермент разворачивается), и/или ее конформационную предпочтительность. Важно отметить, что 4 новые удачи предсказаноо свяжутся с 4D9 экзо участком (голубые сферы на изображения A и B слева) способны затормозить в бипротеазу ВИЧ в биологиеских анализах, выполненными д-ром Инг-Чуань-Линем в лаборатории Джона Элдера. Хотя эти четыре фрагмента очень маленькие, слабые ингибиторы протеазы ВИЧ, они представляют первые соединения, которые мы когда-либо выявили на виртуальных экранах, против этих двух участков, которые были способны затормозить деятельность ВИЧ-протеазы в лаборатории. Как только наши сотрудники показали, что эти фрагменты показывают активность в в отношении ВИЧ-протеазы, эти четыре новые хита были прозваны от "APex41" до "APex44" (для Alex Perryman в экзо сайте 4D9 соединения 1-4).
Открытие этих двух потенциальных аллостерических участков ( на которые мы нацелены в настоящее время ) была представлена в манускрипте “Fragment-Based Screen against HIV protease,” by Alexander L. Perryman, Qing Zhang, Holly H. Soutter, Robin Rosenfeld, Duncan E. McRee, Arthur J. Olson, John E. Elder, and C. David Stout, in the journal Chemical Biology & Drug Design, 75(3), pages 257-268 (2010).
Прочитайте остальную часть этого бюллетеня, чтобы узнать о подробностях этого эксперимента, и как мы идем на это. Для общего резюме проекта FightAIDS @ Home, посмотрите клип YouTube д-ра Алекса Перримана интервьюированного Аароном Роу, журналистом из Chemical & Engineering News (“C&E News”) по адресу: http://youtu.be/V6gzc8uUGJw . Для просмотра вебинара, который обсуждает FightAIDS @ Home и того прогресса, которого мы добились в прошлом году (с последующими 15 минутами вопросов и ответов для публики), смотрите http://www.youtube.com/watch?v=khFbQTcoqyI.
Что такое "расчеты стыковок" (“docking calculations”), виртуальные экраны (“virtual screens") и "лекарственно-устойчивые мутанты" ("drug-resistant mutants”?).
Расчеты стыковок - это способ предсказать насколько хорошо небольшое химическое соединение может связать и заблокировать активность исследуемого белка. Мы используем эти вычисления, чтобы предсказать родовое сходство и результативность соединения, место, где оно соединяется с молекулярной целью и режим, который оно использует, чтобы потенциально заблокировать цель. Эти прогнозы помогают нам направлять и объяснить пробирочные эксперементы ( т.е., мокрые эксперименты в пробирках, чашках Петри, и т.д.) которые выполняют наши сотрудники. Виртуальными экранами являются большие вычислительные эксперименты, которые включают стыковочную коллекцию от сотен и тысяч до миллионов соединений против отдельных регионов критических белковых целей по одному. Эти виртуальные экраны, что мы выполняем на FightAIDS@Home похожи на попытку найти правильный ключ, чтобы открыть конкретный замок на контрольных панелях, которые регулируют вирусный механизм. Однако, и замок и ключи гибкие - они могут менять форму ( преобразовывать их конформации ) так как они покачиваются, трясутся, танцуют, растягиваются и сжимаются в теплой водянистой среде, в которой они проживают. Если, случайно, внутренняя структура замка меняется немного, так как вирус размножается, происходит потенциал для эволюционного совершенствования. Если это изменение в ценной части замка происходит, чтобы помочь вирусу избежать последствий ключа/лекарства (в то же время позволяя ему выполнять свои нормальные биологические функции), то новый замок становится "лекарственно-устойчивым мутантом". Поскольку ВИЧ копирует себя в очень неаккуратной манере, эти случайные изменения происходят очень часто, что дает ВИЧ возможность быстро развивать сопротивляемость различным препаратам, которые используются для борьбы с ним.
Мы ищем новых тормозящих агентов ("inhibitors") (новые ключи), которые не только могут отключить мутантов супер-бактерий ВИЧ, которые уже существуют, но также затрудняют эволюцию вируса в новые устойчивые к лекарствам мутированные формы. Охота за новыми ключами/лекарствами очень запутанный и сложный процесс, по причинам, обсуждавшимся ранее и тому факту, что эти вычислительные прогнозы не являются абсолютно точными. Вдобавок, общее число потенциальных «ключей» (небольшие органические соединения), которые, вероятно, существуют во Вселенной (т.е. размер "химического пространства" ("chemical space") оцениваются как 10 в 60-й степени (т.е. 1 с 60-ю нулями). Мы, очевидно, не можем вычислительно оценить гибкие модели такого большого количества ключей, так что нам приходится сосредоточить те эксперименты на типах ключей, которые которые несколько похожи на типы молекул, которые уже стали утвержденными препаратами ( или маленькие, представительные кусочки этих молекул, называемые "фрагменты" ). Вместо того чтобы искать иголку в стоге сена, мы ищем иголку в многих полях, полных стогов и мы можем только обыскать небольшой процент из них. Чтобы узнать более подробную информацию об этих расчетах стыковок смотрите http://fightaidsathome.scripps.edu/discovery.html или http://gofightagainstmalaria.scripps.edu/index.php/project-details. До сих пор мы получили более 168 тысяч лет бесплатных процессорных расчетов на World Community Grid для продвижения проекта FightAIDS@Home.
Что такое белки, что делает ВИЧ-протеаза и почему мы хотим заблокировать ее деятельность? Белки являются полимерами, которые создаются путем ковалентного присоединения ( постоянные химические крепления ) различных единиц пептидов вместе. Пептиды также называют "аминокислоты" и есть более 20 различных вкусов пептидов, которые делятся на 3 основные категории: заряженные, полярные и гидрофобные. Поскольку белком является полимер, сделанный из пептидов, он также называется "полипетидом". Каждый вид белка состоит из определенной последовательности различных единиц пептидов объединенных в конкретном порядке, чтобы составить линейную цепочку (в чем-то похоже на жемчужное ожерелье, если бы у жемчужин были разные размеры и химические свойства). После того как полипептидная цепь создается, количество и порядок следования различных аминокислот в ней заставляет ее сложиться в определенную коллекцию, или ансамбль, компактных 3-д формы (конформаций). Большинство человеческих белков выполнены в виде индивидуальных, раздельных полипептидных цепей: одна полипептидная цепь производит один белок. Но компоненты ВИЧ, сделаны в совершенно иной манере: когда генетический материал вируса направляет инфицированные клетки для создания белков ВИЧ, производятся длинные, многобелковые полипептидные цепи.
ВИЧ-протеаза это "фермент" ("enzyme"). Ферменты (которые, как правило, имеют имена, заканчивающиеся на "аз") являются белками, выполняющими химическую работу (такую как присоединение вещей друг к другу, разъединене вещей друг от друга или изменение конкретных небольших органических веществ или больших биологических макромолекул). В ВИЧ-протеазу входит длинная, вирусная, многобелковая полипептидная цепь в нескольких различных конкретных местах. Резка этой мультибелковой цепи на различные части, позволит потом этим различным частям свернуться к их нормальным, зрелым конфирмациям. Те, сложенные вирусные белки затем работают вместе, чтобы создать новые частицы ВИЧ, сбежавшие из зараженной клетки ( или "почки" ), взрослеют, а потом заражают новые клетки, которые распространяют инфекцию внутри пациента и позволяют инфекции распространяться на новых людей. Когда активность ВИЧ-протеазы существенно нарушается, то те несколько мультибелковых вирусных полипептидных цепей больше не отделены в эффективной, хорошо упорядоченной манере. Это заставляет зараженную клетку производить незрелые вирусные частицы, которые не способны инфицировать другие клетки. Наибольшее значение играет то, что когда препараты ВИЧ-протеазы сочетали с препаратами обратной транскриптазы ВИЧ, частота смерти, ассоциированной с ВИЧ-инфекциями резко сокращалось. До существования лекарств ВИЧ-протеазы получение ВИЧ было в основном быстрым и ужасным смертным приговором. Когда лекарства ВИЧ-протеазы были соединены с другими классами противоВИЧ лекарствами, чтобы сделать ВААРТ (HAART) коктейли (высокоактивной антиретровирусной терапии), то многие ВИЧ-инфицированные пациенты смогли прожить долгую и продуктивную жизнь с разумным качеством жизни. Однако, поскольку ВИЧ продолжает развиваться в несколько иных формах, которые способны сопротивляться воздействию этих препаратов (то есть, новые лекарственно-устойчивые мутанты супербактерии продолжают появляться и распространяться), мы должны открыть новые виды лекарств, которые смогут отключить этих мутантов.
Что такое аллостерические замедлители реакции (allosteric inhibitors)? Большинство ингибиторов отключает функцию фермента, связываясь непосредственно с "активным участком" ("active site") ( конкретным регионом фермента, где происходит химическая работа) и блокирует его возможность функионировать. 9 утвержденных FDA препаратов являются примером этих традиционных типов ингибиторов: они связывают и блокируют активный центр в полости туннеля в центре протеазы, что предотвращает вирусный мультипротеиновый полипептид от возможности связаться внутри этого туннеля и раздвоиться. Аллостерические торможения похожи на то, как положить защелки на ручки ножниц, чтобы предотвратить лезвия от открывания и закрывания и резать вещи. Большинство мутаций в ВИЧ-протеазе, вызывающие устойчивость обычно происходит внутри этого активного участка туннеля; они предохраняют лекарства от возможности тесно переплестись, но они все же позволяют вирусному мультипротеиновому полипептиду переплетаться и раздваиваться на разные куски. Активный центр протеазы ВИЧ охраняют два высококвалифицированных мобильных клапана, которые образуют крышу туннеля активного сайта. Эти клапаны должны быть в состоянии открыться, чтобы разрешить вирусному мультипротеиновому полипептиду войти в активный участок и они должны быть в состоянии закрыться, для того, чтобы позиционировать правильную область этого полипептида внутри активного участка, так что он плотно связывается и создает надлежащую химическую окружающую среду, которая позволяет измельчениям происходить. Эти клапаны должны потом снова открыться, чтобы заставить размножившиеся продукты сбежать (а затем свернуться) и чтобы разрешить новому мультипротеиновому полипептиду ( или новой области свежеразмножившихся мультипротеиновых полипептидов) переплестись. Мы ищем аллостерические ингибиторы, потому что мы хотим найти способ регулировать поведение открытия и закрытия клапана. Если клапаны не смогут открываться и закрываться, то ВИЧ-протеаза не сможет функционировать.
Некоторые лекарственно-устойчивые мутации ВИЧ-протеазы, похоже, предпочитают выборки конформации, которые открывают клапаны чаще чем обычно, "дикого типа" версия предпочитает их. Это делает более трудным для препаратов плотно сплестись с активным участком и закрыть эти клапаны в закрытую конформацию. Если мы сможем обнаружить аллостерические ингибиторов протеазы, которые помогают закрыть заслонки и/или помогают держать клапаны закрытыми, тогда эти соединения должны помочь восстановлению потенциала теперешних препаратов протеазы против этих мутантов супербактерий.
Поскольку мутации случайным образом возникают, когда вирус воспроизводит себя, это гораздо сложнее и занимает больше времени для вируса накапливать мутации в обоих аллостерическом участке и в активном участке вирусной молекулы ( таким образом, что предотвращает оба типа препаратов от возможности связаться, хотя все еще разрешая энзиму эффективно функционировать ). Следовательно, разработка новых комбинаций, которые включают ингибиторы активных участков ВИЧ-протеазы и аллостерические ингибиторы протеазы должны не только отключить мутантов супербактерий протеаз, что существуют в настоящее время, она должна также препятствовать появлению новых типов супербактерий в будущем. Существует ряд доказательств в поддержку этой амбициозной долгосрочной цели: в других системах, таких как Bcr-Abl ( задание для раковой химиотерапии ) и обратной транскриптазы ВИЧ, было показано, что комбинации ингибиторов активного участка и аллостерических ингибиторов замедлит развитие мутаций, усточивых к препаратам.
Как мы обнаружили эти новые фрагменты, которые связываются с ВИЧ-протеазой? 30-й эксперимент FightAIDS@Home задействовал стыковку ~360000 различных соединений из библиотеки "Asinex" с двумя потенциальными аллостерическими участками, которые мы помогли оьнаружить ранне. См. статью от 2010 года, ссылка на которую была приведена внизу страницы 2. По сути, эксперимент 30 состоит из двух различных половин - первая половина включает в себя "скрининг" этих 360000 соединений против потенциальных аллостерических участков на верху клапанов, используя 1F1-связанную кристаллическую структуру протеазы ВИЧ как цель. Вторая половина задействует стыковку этих 360000 соединений против потенциальных аллостерических участков на сторонах протеазы ВИЧ, используя 4D9-связанную кристаллическую структуру протеазы ВИЧ как цель. Каждая половина эксперимента была проанализирована независимо друг от друга. Вычислительные средства, разработанные в доме доктора Стефано Форли (с некоторой помощью д-ра Ruth Huey и адъюнкт-профессора Мишель Саннер) были использованы для обработки, а затем измерения взаимодействия отображений во всех этих результатах стыковки. Эти инструменты были затем использованы для "фильтрования" результатов, для того, чтобы собрать небольшое число топ-рейтинг соединений. Доктор Алекс Перриман создал определенный набор активных и интерактивно основанных фильтров для каждого из двух участков и он обычно визуально осматривает и переоценивает топ соединений, которые прошли через каждый набор фильтров для определения небольшого набора перспективных соединений кандидата.
Для 360000 соединений пристыкованных к участку 1F1 в верхней части клапанов, 33 соединения прошли через первый набор фильтров и были визуально наблюдаемы ( с использованием PMV, Python Molecular Viewer, програму из лаборатории адъюнкт-профессора Мишель Саннер и лаборатории профессора Арта Олсона. Из этих 33 топ-реййтинговых соединений мы решили заказать 10 соединений, чтобы наши сотрудники могли изучить их во влажных экспериментах лаборатории. Эти 10 соединений и соединения обсуждаемые на страницах 7-8 были приобретены с помощью некоторых средств, которые были переданы в дар FightAIDS@Home от IBM International Foundation (т.е., частью призовых денег, которые выиграл компьтер IBM "Ватсон" на Jeopardy, см:
http://www-03.ibm.com/press/us/en/pressrelease/33752.wss или
http://www.scripps.edu/newsandviews/e_20110228/etc.html). Из этих 10 перспективных соединений, 6 фрагментов были классифицированы как «хиты» по результатам, по крайней мере, одного типа экспериментального анализа. Наши сотрудники в лаборатории Стаут в настоящее время пытаются кристаллизовать эти хиты с ВИЧ-протеазой, для получения доказательств о том, где на самом деле эти соединения связываются и подробный режим привязки, который они показывают в этом месте. Эти 6 хитов, изображены на рисунках E-K на стр. 5, еще не отображаются любое замедление активности протеазы ВИЧ. Они очень мелкие фрагменты, в конце концов. о 5 из этих 6 фрагментов (A3, A5, A6, A7, и A8) вызвали значительный сдвиг в тепловой стабильности протеазы ВИЧ в анализах DSF (differential scanning fluorimetry) (дифференциальной сканирующей флуориметрии) в лаборатории Торбетта, где доказали, что они способны связываться где-то на ВИЧ-протеазе (в растворе) и влиять на ее общую стабильность, в зависимости от дозы (то есть, большое количество соединения вызывает большие изменения в термической стабильности протеазы, что показывает, что соединения связываются определенным образом). Фрагмент A4 не вызывает значительных тепловых изменений, но он был классифицирован как хит, в соответствии с SPR (поверхностный плазменный резонанс, который включает в себя анализ изменения угла отражения лазера, возникающего когда соединение связывается с белком-целью, который был присоединен к поверхности золота или серебра, см. http://en.wikipedia.org/wiki/Surface_plasmon_resonance) экспериментами, проводимыми лабораториями Торбетта и Финна. Фрагмент A4 также отображает 53 мкм близость в BSI экспериментах, выполненными лабораторией Финн (обратное рассеяние интерферометрии, новая техника, которая определяет максимальное изменение показателя преломления, что происходит, когда растворенное вещество связывает с разбавленный раствор белка; когда соединение меняет общей конформационные предпочтения протеазы, это приводит к изменению показателя преломления раствора). BSI данные также зависят от дозы. Фрагменты A5 и A8 также отображаются низкой близостью мкм в BSI, в то время как фрагмент A7 отображается > 1 мм близости в BSI (то есть, A7 связывает в 1000 раз менее плотно). Другие фрагменты не показалии хорошо интерпретируемых сигналов в BSI. Различные типы соединений работают лучше или хуже в различных типах экспериментальных анализов, поэтому наши сотрудники должны выполнять много различных типов экспериментов, чтобы понять, насколько хорошо эти соединения фактически действуют. Мы используем данные по этим 6 хитовым фрагментам, чтобы руководить открытием и развитием более крупных и мощных соединений, которые, надеемся, смогут связываться с участком 1F1 и показывать торможение активности протеазы ВИЧ. Но по-прежнему еще предстоит выяснить способна ли связывание на участке 1F1 действительно отключить функцию активного участка.
Из 360000 соединений состыкованных с участком 4d9 по бокам протеазы, 160 соединений пропускают через другой набор активных и интерактивно основанных фильтров и были визуально осмотрены доктором Алексом Перриманом. Мы решили заказать 34 из этих соединений, из которых 4 были классифицированы как хиты. Все 4 из этих хитов (APex41 до APex44, смотрите рисунки L-O на этой странице) вызывают значительный сдвиг в термической стабильности протеазы ВИЧ в анализах DSF выполненных в лаборатории Торбетта. APex41 и APex42 показывают 4.3 и 2.7 мкм близость, в экспериментах BSI выполненных в лаборатории Финна, в то время как у APex43 и APex44 не было обнаруженных сигналов в BSI. Важно отметить, что все 4 из этих хитов показывают некоторое замедление активности протеазе ВИЧ в биологических анализаз, выполненных в лаборатории Элдера. При концентрации 100мкм APex41 сдерживает активность протеазы на 9%, в то время как APex42 до 44 сдерживает активность протеазы на 6%, 2% и 3%, соответственно. Хотя это очень слабые ингибиторы активности протеазы ВИЧ, они небольшие фрагменты, и они первый набор соединений, обнаруженных в виртуальных экранах против этих потенциальных аллостерических участков, что на самом деле ингибирует протеазы ВИЧ активности в биологических анализах. Но, как и с другим набором хитов, мы до сих пор еще не имеем никаких доказательств о том, где на самом деле эти соединения связываются с ВИЧ-протеазой. Наши сотрудники в лаборатории Стаут в настоящее время пытаются кристаллизовать эти хиты с протеазы, для создания доказательства того, где эти соединения связываются и какие взаимодействия они образуют. Мы также собираемся начать новый тип сотрудничества с лабораторией Kojetín на TSRI-Флорида, которые будут связаны с использованием спектроскопии ЯМР чтобы предоставить дополнительные данные о том, где эти хиты на самом деле связываются. Мы используем данные по этим 4 хитам, штриховки "автолиганд", медицинское понимание химии, предоставленное лабораторией Фокина и лабораторией Финна, чтобы направлять дизайн и разработку бОльших которые, мы надеемся, свяжутся с участком 4d9 с более высоким сродством и про демонстрируют более значительное ингибирование активности протеазы ВИЧ.
Как мы расширили эксперимент 30, чтобы найти более крупные и мощные ингибиторы? Поскольку четыре хита, APex41 - APex44, показывают замедление активности протеазы ВИЧ, и были структурно похожи друг на друга, их структурные детали были использованы для руководства строительством "целенаправленной библиотеки" примерно 2600-ти новых соединений. Доктор Перриман искал и визуально исследовал сервер ZINC (http://zinc.docking.org) чтобы вручную подобрать эти 2600 соединений. Большинство из этих соединений гораздо больше и сложнее, чем оригинальный APex4, однако, некоторые из них имеют такой же размер, но они позволят нам изучить различные Структурно-Активные Отношения, для того, чтобы определить, какие типы структурных особенностей увеличивают или уменьшают активность этих соединений. Эта целенаправленная библиотека 2600-ти соединений была затем простыкована с той же 4D9-граничной кристаллической структурой ВИЧ-протеазы, но на этот раз мы использовали наши местные Linux кластера на TSRI. После применения аналогичных наборов энергетических и интерактивно-основанных фильтров, 213 соединений были пожаты и их связанные режимы были визуально освидетельствованы д-ром Перриманом. Во время этого процесса визуального осмотра, результаты вычислений "автолиганда" были использованы как руководство. Автолиганд это программа из лаборатории Олсон, которая обнаруживает лиганды связанных участков и описывает в общих чертах химические соединения, которые должны иметь максимальное сродство данного объема. Смотрите рисунки P и Q и... (пропущена строчка) Harris, R., Olson, A.J., and Goodsell, D.S. Автоматизированнре прогнозирование лигандов связывающих участки в белках. Белки, 70 (4): 1506-1517 (2008). Мы определили и заказали 43 новых соединений-кандидатов. Эти 43 кандидата в настоящее время изучаются в биологических анализах, выполняющихся в лаборатории Элдера. Анализы начались недавно и все еще продолжаются, но по крайней мере 2 из этих 43 кандидатов, уже показывают некоторое замедление активности протеазы ВИЧ. Исходя из слабо связывающих фрагментов и расширения их, чтобы найти гораздо больше, гораздо более мощные лекарственно-подобные молекулы, вероятно, потребуется много различных шагов и несколько лет. Но наше путешествие на этом захватывающем пути открытий уже начало приносить свои плоды.
Хотя эти направления исследуются, мы в настоящее время скриним миллионы других соединений против этих потенциальных аллостерических участков на FightAIDS@Home. Пожалуйста, помогите нам найти аллостерические ингибиторы целей препаратов от ВИЧ жертвуя неиспользуемые компьютерные циклы в World Community Grid.
Рис. на стр.2:
Эти изображения показывают местоположение двух потенциальных аллостерических участков связывания, что были направлены в FightAIDS@Home эксперимент 30. Рисунки A и B показывают местонахождение "участка 4D9" по ВИЧ-протеазы, в то время как C и D показывают расположение "участка 1F1" в верхней части клапанов. Голубые сферы представляют собой наложение 4 новых хитов фрагментов, выявленных в виртуальных экранах против участка 4D9, в то время как желтые сферы являются наложением новых 6-ти фрагментов хитов, обнаруженных в виртуальных экранах против участка 1F1. A и D изображают ленточную/мультяшную модель позвоночника протеазы, в то время как B и C показывают поверхность протеазы. Активный участок, ( где связываются 9 утвержденных FDA препаратов ВИЧ-протеазы) это полый туннель в центре каждого изображения.
Рис. на стр.5:
Эти изображения показывают 6 новых фрагментов хитов, выявленных в виртуальных экранах против участка 1F1 в верхней части клапанов. Рисунки от E до J показывают предсказанные режимы связывания соединений A3, A4, A5, A6, A7 и A8 как желтые сферы на фиолетовой поверхности представления протеазы, в то время как K изображает наложения этих 6 хитов на ленточную/мультяшную модель основы ВИЧ-протеазы.
Рис. на стр.7:
Эти изображения показывают предсказанный режим связывания 4-х новых хитов, открытых против экзо участка 4D9 как голубые сферы на пурпурной поверхности ВИЧ-протеазы. Изображение L изображает APex41, M отображает APex42, N показывает APex43, и O представляет APex44. APex41 также показан как желтые сферы на верху страницы 1, наряду с заполнением Автолиганд.
Рис. на стр.8:
Изображения P и Q показывают результаты расчетов АвтоЛиганда на границе участка 4D9 кристаллической структуры протеазы. Ленточно/мультяшный режим основы протеазы показан на Q и R, поверхность протеазы отображается в P, в то время как заполняющие пространство "CPK" представление используется в S. 43 новых кандидатов показаны как голубые палки в R и S.
